一 、试剂盒产品信息  

二 、操作步骤 

1. 提取类器官原代

1. 取材后将肺组织拍照并登记信息 ，迅速放在4 ℃预冷的含有组织保存液Ⅰ的取样管中 。
2. 将组织放入培养皿中 ，利用清洗液Ⅱ清洗3-5次后 ，利用眼科剪将肿瘤组织剪成体积约为 1~3 mm³的组织块。
3. 加入适量肺组织消化液Ⅲ ，37 ℃震荡消化10-20 min （该过程随时观察消化情况） 。
4. 取少量液体在显微镜下观察 ，镜下观察到较多的单个细胞或70 μm以下的细胞簇后 ， 加入三倍体积清洗液Ⅱ终止消化 。
5. 使用100 μm筛网进行过滤 ，收集滤液后在300 g 离心 5 min 。弃上清后 ，添加清洗液Ⅱ重新重悬离心 。
6. 观察收集到的组织体积 ，添加 25-30倍组织体积的基质胶重悬铺板 。
7. 以24 孔细胞培养板为例 ，每孔点胶25 ul基质胶混合物进行铺板（将基质胶始终置于冰上） 。
8. 将铺好的培养板放入 37℃培养箱中 10- 15 min 成胶 ， 添加肺类器官培养基Ⅳ（恢复室温）进行培养 。

2. 类器官传代培养

1. 吸去培养基 ，每孔添加 1-2 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ 。轻柔吹打基质胶 ，收集在 15 ml 离心管中 ，4 ℃ 静置10 min 。
2. 如果类器官数量不足或体积较小 ，则离心 5min 弃去上清 ，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ ，重悬移入1.5 ml 离心管 ，300 g离心5 min ，弃去液体 ，进行第4步 。
3. 如果类器官数量较多或体积较大 ，则离心5 min弃上清 ，添加适量类器官传代消化液Ⅴ 。消化2-3 min ，添加类器官传代缓冲液Ⅵ终止消化 ，离心 5 min 弃去混合液 ，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ ，重悬移入1.5 ml离心管 ，300 g离心5 min ，弃去液体 ，进行第4步 。 
4. 类器官收集后 ，添加基质胶重悬 ，每孔25 μl基质胶铺在24孔细胞培养板中 ，放置培养箱中10-15 min ，最后添加500 μl 肺类器官培养基Ⅳ 。

3. 类器官冻存 

1. 吸去培养基 ，每孔添加 1-2 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ 。轻柔吹打基质胶 ，收集在15 ml 离心管中 ，4 ℃ 静置10 min 。
2. 离心5min弃去上清 ，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ ，重悬后300 g离心5 min ，弃去上清 。 
3. 添加适量类器官冻存液Ⅶ，轻柔吹打重悬 。在-80 ℃ 中进行程序降温 ，最后可移入液氮长期保存。

4. 类器官复苏

1. 提前在15 ml 离心管中加入7-10 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ 。
2. 从液氮罐中取出冻存的类器官细胞 ，快速置于37 ℃水浴锅中融解 。
3. 将溶解后的类器官细胞快速转移至 15 ml离心管 ，使用移液管轻轻吹打6-8次 ，300 g  离心5 min ，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀 。添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ ，重悬移入1.5 ml 离心管 ，300 g离心 5 min 。
4. 重悬基质胶 ，每孔 25 μl 基质胶铺在24孔细胞培养板中 ，放置培养箱中10-15 min 成胶 ，添加500 μl肺类器官培养基Ⅳ 。

三 、注意事项 ：

  1. 本产品仅限于科学研究使用 ，不得用于临床诊断等其他用途 。  

  2. 为了您的生命安全 ，请遵守实验操作规范 ，穿实验服并佩戴一次性手套操作 。