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操作步骤：

1
、 原代

1. 取材后的肝癌组织须在2-8℃含有组织保存液的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。
2. 准备若干培养皿
   
   
   ，加入4℃预冷的肝癌类器官培养缓冲液备用
3. 取样瓶消毒
   
   ，将组织放入培养皿中，利用肝癌类器官培养缓冲液清洗三次后，利用眼科剪或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为1~3mm³的组织块
   。
4. 组织用肝癌原代组织消化液消化，37℃震荡消化10-20min
   ，（消化过程中随时观察消化情况）。
5. 取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70μm以下的细胞簇后，加入三倍体积肝癌类器官培养缓冲液终止消化
   。
6. 使用100μm孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后
   ，于300g富集离心5min后移去上清，添加肝癌类器官培养缓冲液重新重悬离心。
7. 基质胶计算
   ：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。
8. 24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）
   。
9. 将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶
   ，添加肝癌类器官培养基（恢复室温）进行培养。

2
、 类器官传代培养

1. 移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml4℃类器官缓冲液放置2min
   。
2. 移液抢轻柔吹打基质胶
   ，收集在15ml离心管中
   ，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
3. 1类器官数量不足或体积较小时：离心5min弃去上清，添加适量肝癌类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步
   。2类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液消化2-3min，添加肝癌类器官缓冲液终止消化
   ，离心5min弃去混合液，添加适量肝癌类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步
   
   。
4. 类器官收集后，添加基质胶重悬
   ，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500μl肝癌类器官培养基。

3、类器官冻存

       1.移液器吸去培养基
，每孔添加1-2ml4℃类器官缓冲液放置2min。

       2.移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min
。（每6-8孔为一组）

       3.离心5min弃去上清，添加适量肝癌类器官缓冲液再次重悬，300g离心5min弃去液体
。

       4.添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管
，每管体积1.4ml。

       5.做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存，

4、 类器官复苏

1. 取10ml肝癌类器官培养缓冲液于15ml离心管中
2. 从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于37℃水浴锅中融解。
3. 水浴融解过程中
   ，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在1-2分钟内完全融解。
4. 将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次
   ，300g离心5分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀
   。添加适量肝癌类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
5. 基质胶重悬
   ，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中
   ，放置培养箱中10-15min成胶，添加500μl肝癌类器官培养基。