1 、 什么是病理学实验技术 ？

病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学 、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法 。

2 、 什么是组织制片技术及其目的 ？

组织经过固定 、切片和染色后 ，光波通过被检组织成分时 ，波长和振幅发生改变 ，在显微镜下能清晰的观察其组织结构 ，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术 。

目的生物学标本在生活状态下多为无色透明 ，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡 ，其结构就会失去正常状态 。必须对组织采取固定 、切片和染色措施 ！

3 、 组织非切片制片方法有哪些 ？

1组织分离标本 2.组织活体标本 3.组织涂片标本4.磨片标本5.整体封存（压片）标本6.组织铺片标本7.组织印片标本等

4 、 根据所使用支持物质的不同 ，组织切片方法分为哪些种类 ？组织切片的主要程序 。

根据所使用支持物质的不同 ，切片方法分为 ：1.石蜡切片法2.火棉胶切片法3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术）5.树脂切片6.碳蜡切片

组织切片的主要程序 ：

取材 、固定→脱水→透明 、浸透→包埋 、切片→贴片 、染色→浸洗→脱水→透明→封固 。

5 、 标本主要来源及取材的要求 、取材主要注意事项 ？

来源 ：临床活体检查 ，手术切除 ，病理解剖，实验动物等

要求 ：

1 、根据实验目的和要求及病变程度合理取得组织材料 。

2 、取材的过程迅速 、准确

组织取材注意事项1.材料保持新鲜2.标本大小适宜3.勿使组织块受挤压4.尽量保持组织的原有形态5.选好标本切面6.保持材料的清洁7.切除不需要部分8.明确编号 ，登记

6 、 何谓固定 ，固定的目的及主要方法有哪些 ？影响固定的因素及注意事项 。常用固定液有哪些 。

标本（组织）固定是指从人体内或动物体内取下的材料立即浸泡在化学试剂中 ，借助化学试剂的作用 ，将组织 细胞结构保存起来 ，使其形态结构近似生活状态的一种手段。

固定的目的 ：

1）防止标本的自溶与腐败 ，以保持组织细胞的固有形态 。

2）使组织细胞内的蛋白质 、脂肪 、糖和酶等各种物质成份沉淀或凝固成不溶性物质 ，以保持它原有的结构与生活时相仿 。

3）可增强染色的作用 。使组织中的各种物质沉淀凝固而产生不同的折射率 ，造成光学上的差异 ，以便染色后易于鉴别和观察 。

4）固定剂兼有硬化作用 ，使组织硬化 ，增加组织硬度 ，便于制片 。

5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 。另外 ，对某些具有传染性的标本 ，能防止疾病的扩散 。

固定的方法 ：

物理方法 干燥 ：血涂片 高热 ：细菌涂片 低温骤冷 化学方法 使用化学试剂配制成固定液固定

影响固定的因素 ：1 .组织固定必须新鲜：无论取人体或动物组织，都必须立即投入固定剂 。2.防止组织因固定剂的作用而发生变形 ：3.标本大小 ：在保证形态结构完整性的同时 ，厚度不超过5mm 。4.固定液的量 ：一般为组织块体积的20-30倍（不得少于标本体积的5倍） 。5.固定时间 ：根据组织的种类 、大小 ，固定剂种类 、性质 、渗透力的强弱而定 。6.固定温度 ：室温（20-25℃）或低温（如4℃） ，一般不应超过40-45 ℃ 。7.选择适当的固定液 ：8.促使固定

注意事项 ：免疫组化固定方法的原则是 ：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下 ，应选用浓度最低的固定液和最短的固定时间 。为此 ，固定组织时应该 ：

1）组织新鲜 ，尽早 、尽快固定 。2）组织块尽量小 。3）固定后充分水洗 ，减少固定液造成的人工假象 。 4）针对抗原 、染色法选择最佳的固定方法  。

常用的固定剂 ：

1）10%福尔马林缓冲液（pH7.4）2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4） 3）Bouin液 4）Zamboni’s液 5）丙酮 6）95%乙醇 7）A-F液 7．何谓脱水 ，脱水的目的 、常用脱水剂及脱水注意事项 。

定义 ：利用某种化学试剂逐步将标本内部吸收的水分置换出来 ，以使标本处于无水状态 ，这一过程叫脱水 。 目的和原则1有利于标本的下一步处理 ，即透明 、浸透 、包埋 2有利于切片的操作 3有利于标本的长久保存

常用的脱水剂 ：1.单纯脱水剂 ：如乙醇、丙酮和甲醇 2.脱水兼透明剂 ：如正丁醇 、叔丁醇等

注意事项 ：脱水时必须由低浓度脱水剂开始 ，逐步转入高浓度脱水剂 ，经过各级浓度的脱水剂使其所含的水分逐渐减少而代之以脱水剂 。防止组织过度收缩变形 ，或脱水不完全而影响制片效果 。

8．石蜡包埋程序

1）组织取材3mm厚度 ，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时 。

2）组织流水冲洗6-12h 。

3）70％酒精2-4h 。

4）80％酒精2-4h 。

5）90％酒精2-4h。

6）95％酒精（Ⅰ 、Ⅱ）2-4h 。

7）100％酒精（Ⅰ 、Ⅱ ）1-2h 。

8）二甲苯（Ⅰ）5-30min 。

9）(二甲苯（Ⅱ） 5-30min) 。

10）浸蜡（Ⅰ 、Ⅱ ）2h 。

11）组织包埋

9 、石蜡切片与冰冻切片的优缺点 ？

石蜡切片优点1.标本大小灵活2.切片厚度均匀（1-200μm）3.可少量或批量制作4.切片保持时间长 缺点1.不能很好地保存细胞组织内酶或抗原的活性2.脂肪被溶解3.不能保障大且坚硬组织的切片质量

冰冻切片法优点• 切片制作时间短• 较好的保存脂肪和类脂 、酶及抗原活性• 可应用于脂肪显示 ，酶的定位 、定性甚至定量 、组织荧光 、免疫荧光和放射自显影等方面

缺点• 标本结构和形态的显示逊色于石蜡切片• 冷冻过程中易形成“冰晶”• 难以制作连续切片和薄的切片

10 、染色的目的 ，普通染色 、特殊染色 、复染色定义 。常用染色方法 。

染色的目的 ：将标本切片浸于染色剂内 ，经一定的时间 ，使组织或细胞及其他的成分被染上不同的颜色 ，产生不同的折射率 ，便于在光镜下进行观察 。

普通染色 ：最广泛应用的是苏木精和伊红染色 ，又称常规染色 。 特殊染色 ：为显示特定的组织结构或其他的特殊成分 。 复染色 ：衬托主染色所进行的染色 。 常用的染色方法 一）苏木精（素） ：是现今最常用 、最有价值的常规细胞核染色剂 ，习惯上称苏木精是碱性染料 二）伊红 ：是一种胞浆较理想的染色剂 。常用伊红Y 。酸性染料组织成分呈弥漫性染色 。

11 、石蜡切片常规染色步骤 。

1） 脱蜡至水

①二甲苯Ⅰ 、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 （5～10）min×2或3次③依次95%乙醇 、90%乙醇 、80%乙醇 、70%乙醇各5～10min④蒸馏水浸洗 2～5min 2）苏木精染色 ：

① 苏木精1-10min 。② 自来水流水冲洗 。③ 0.5%盐酸-乙醇分色 ，数秒-数十秒 。自来水快洗 。

④ 0.5%氨水蓝化 ，30sec-1min ，自来水冲洗⑤ 光镜下镜检细胞核分色程度 。⑥ 自来水流水冲洗3min。

3）伊红染色

① 1%伊红1-10min 。 ② 蒸馏水快洗 。

5.脱水 、透明和封固 ：

① 70% 、80% 、90%乙醇速洗 ，每级数秒-数十秒 。② 95%30sec-1min.光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比 。 ③ 100%乙醇 ，3-5min ，2次 。④ 二甲苯Ⅰ 、Ⅱ,各5-10min 。⑤ 封片:中性树胶

12 、组织化学定义及特征 。

组织化学（histochemistry)或细胞化学（cytochemistry） ：是基于已知的化学反应 ，在组织或细胞原位上显示出组织或细胞中的化学物质 ，并研究其化学性质及功能关系的一门技术 。是在形态学的基础上 ，研究组织或细胞中化学物质的形态 、化学成分及定位 、定量和代谢状态的学科 。

组织化学的特征 ：应用物理的和化学的方法来查明细胞或组织的化学成分 ； 用组织学 、化学 、物理学原理 ，研究细胞或组织的结构 、功能与化学的关系 ；

对细胞或组织成分的定位 、定性 、定量的特征进行研究 ，来认识细胞或组织结构与功能的关系 。 具有较强的特异性 。

13 、组织化学技术的基本要求 。

为了能在完好的结构上同时显示其化学物质 ，组织化学技术必须做到 ： （1）保存组织（细胞）在生活状态下的结构 ；

（2）保存组织（细胞）内的生前化学成分 、酶活性及检测目的物；

（3）所使用的染色方法是按照已知的化学或物理反应原理进行 。

（4）反应产物应在组织结构上形成稳定的有色沉淀物质 。

（5）检测手段要有高度的敏感性、特异性和可重复性 。

（6）生成物的反应产物必须在原位沉淀 ，保证定位的精确性及稳定性 。

14 、组织（细胞）化学基本步骤冰冻切片或石蜡切片等常规处理后 ，再进行组织（细胞）化学染色 ，在光镜下观察 。

15 、组织（细胞）化学染色方法分类 。

纯化学方法 ：Schiff反应法 、偶氮偶联法、金属沉淀法 、联苯胺反应 、四唑盐反应

类化学方法 ：属某些特殊染色技术 ，如：Best洋红染色 显示糖原 ，Baker酸性苏木精染色 显示磷脂 ，Mayer黏洋红与黏苏木素 显示黏蛋白

物理学方法 ：1）脂溶染色法2）荧光分析3）放射自显影 物理化学方法等

16 、糖类 、蛋白质 、核酸及脂类物质的常用显示方法 。 糖类物质的显示方法 ：

PAS显示法（Periodic Acid Schiff） 阿利新蓝法（Alcian Blue） 阿利新蓝-PAS复合法（Alcian Blue-PAS） 胭脂卡红法（Carmine method） 甲苯胺蓝法 硫堇法等 。

蛋白质显示方法 ：

1 、pH4.2以下的酸性溶液中 ，用坚牢绿 、溴酚蓝 、丽春红-2R等酸性染料染色 ，出现阳性结果表明有蛋白质存在

2 、在pH8.0以上的碱性溶液中 ，用酸性染料染色 ，呈阳性结果表明含碱性蛋白质

3 、若第2步为阴性结果 ，则改在酸性溶液中用碱性染料（亚甲基蓝）染色 。

核酸显示 ：1 、显示DNA  ： Feulgen法试剂 ：Schiff试剂 、盐酸 、亚硫酸氢钠 2 、核仁组成区和酸性粘多糖复合显示法 ：试剂 ：2%的甲酸 、2%的明胶 、50%的硝酸银 、阿申蓝（8GX） 、醋酸溶液3 、粘多糖和核仁组成区双染法试剂 ：Schiff氏试剂 、胶性银液 4 、RNA和DNA的甲绿-派若宁显示法试剂 ：甲绿 、派若宁 。

17 、酶组织（细胞）化学 、常用方法及影响酶活性的因素 。

酶组织（细胞）化学 ：用组织（细胞）化学方法显示酶在组织或细胞内的定位的技术 。

常用的方法 ：酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶

影响酶活性的因素 ：

1  、温度 ：大部分酶反应的合适温度为37℃ 。

2 、 pH ： 酶有适合酶反应速度的pH(大部分为7.0

3 、抑制剂 能使酶活性降低的物质

4 、激活剂 能使酶活性增高的化学物质

5  、底物浓度对酶反应速度的影响

1 、免疫组织（细胞）化学概念及分类 。

免疫组织（细胞）化学 ：是应用免疫学的抗原--抗体反应为理论基础 ，用标记的特异性抗体（或抗原）对组织（细胞）内的相应抗原（或抗体）进行定性 、定位 、半定量检测 ，经组织化学的呈色反应 ，利用光镜、荧光显微镜或电子显微镜进行实验结构观察的技术 。

按标记物标记的是抗体还是抗原 ，可将免疫组织化学分为 ：标记抗体法 ，标记抗原法 。亚洲必赢一般所用多为标记抗体法 。

2 、免疫组织化学的突出优点 。

1.高度的特异性 ：抗原--抗体反应是特异性最强的反应之一 。免疫组织化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体 ，具有高度的识别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平 。2.敏感性高 ：现代免疫组织化学采用各种有效方法最大限度保存细胞或组织内待检物质的抗原性 ，或采用各种增敏方法 ，或使用高敏感、高亲和力的抗体等手段 ，保证可检出细胞内超微量的抗原成分 ，用显微镜观察结果 。因此 ，它是在细胞 、分子水平或基因水平的检测技术 。3.方法步骤统一 ：若掌握一种基本的技术操作方法步骤 ，则一通百通 。4.形态 、机能和代谢密切结合 ：免疫组化是一种综合性检测手段 ，将定性 、定位和半定量密切结合 ；将形态 、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术 。

3 、免疫组化的全过程。抗原的提取与纯化→免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）→抗体效价检测和提取→标记物与抗体集合形成标记抗体→组织（细胞）标本的处理→抗原抗体反应和呈色反应→显微镜下观察结果

4 、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系 。 抗原（antigen） ：凡是能刺激机体产生抗体 ，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原 ；物质具有的这种特性称为抗原性 。

抗体（antibody） ：是机体受抗原刺激后 ，在体液内出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白 ，称免疫球蛋白（Ig） 。含免疫球蛋白的血清称免疫血清 。

抗原与抗体的关系：抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因 ，决定免疫反应的特异性 。机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体 、致敏淋巴细胞等物质 ，是机体排除异体物质的保护性反应 ，没有抗原的刺激 ，机体不能产生抗体 ，没有抗原物质，也无法检测抗体的存在 ；利用抗体可以检测抗原物质的存在 。

5 、抗原的特性 、种类 。

抗原具有两种特性 ：①免疫原性 ：抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性 。②反应原性 ：抗原分子能与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。

抗原的种类 ：根据引起抗体产生的特点 ，抗原可分为两大类 ：

（1）完全抗原

（2）半抗原 ；

根据抗原来源与机体的亲缘关系分类（1）异种抗原（2）同种异型抗原（3）自身抗原 ； 根据引起免疫应答依赖T细胞的关系分类（1）胸腺依赖性抗原（2）非胸腺依赖性抗原 根据自然来源分为内源性抗原和外源性抗原

根据制备来源和方法分为天然抗原 、人工抗原和合成抗原

6 、多克隆抗体和单克隆抗体。

多克隆抗体（Polyclonal AB）和单克隆抗体（Monoclonal AB） ：一株B淋巴细胞（一个克隆）只能产生针对一个抗原决定簇的抗体 ，那么由许多株B淋巴细胞针对多个抗原决定簇所产生的抗体就称为多克隆抗体 。针对某单个抗原决定簇 、由单株B淋巴细胞所产生的抗体 ，称为单克隆抗体 。

7 、免疫组织（细胞）化学基本步骤 。•取材•固定•制片•酶消化处理•抗体处理•免疫染色•结果判断

8 、抗体稀释的原则 。阳性物质着色应鲜明 ，背景应浅或不着色 。抗体效价越高 ，孵育时间越长 ，方法越敏感抗体稀释度应越高 。

1.免疫荧光组化技术定义及常用荧光色素 。

免疫荧光组织（细胞）化学 ：是利用荧光色素标记抗体（抗原）与组织切片或细胞涂片中的相应抗原（抗体)反应 ，形成抗原（抗体）与标记抗体（抗原）复合物 ，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素 ，并在显微镜下呈现特异性荧光反应 ，从而定位抗原或抗体的技术 。利用荧光显微镜观察标本 ，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色） ，从而确定抗原或抗体的性质 、定位 ，以及利用定量技术测定含量 。

常用的荧光色素包括 ：异硫氰酸荧光素（FITC）四甲基异硫氰酸若丹明（TRITC）四乙基若丹明（RB200） 2. 免疫酶组织（细胞）化学技术 ，理想标记酶应具备的条件 ，常用标记酶的反应底物及呈色 。

免疫酶组织（细胞）化学是免疫组织（细胞）化学中最常用的方法之一 ，它是在抗原 、抗体特异反应存在的前提条件下 ，借助于酶细胞化学的手段 ，检测某些物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门技术 。 理想的标记酶应当具备 ：

•①酶催化的底物必须是特异的 ，且容易被显示 ，所形成的产物易于光镜或电镜下观察 ； •②所形成的终产物沉淀必须稳定 ，不扩散 ，有良好的定位 ； •③酶与抗体结合不影响Ag－Ab的特异性反应 ； •④在组织与体液中不存在内源性的酶及其底物 。

•⑤中性pH 时 ，酶应稳定 ，标记抗体后 ，保存1-2 年活性不应改变，且酶的催化活性越高越好 ； 辣根过氧化物酶（HRP)底物显色剂 ①DAB（3’, 3-二氨基联苯胺） ：显色后阳性反应产物呈棕褐色 ； ②AEC （3, 氨基-9-乙基卡巴唑） ：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色 。

碱性磷酸酶(AP)偶氮染料中 ，fast blue（快蓝）和fast red（快红）的产物分别为蓝色和红色

3.酶桥法 、PAP法原理 。酶桥法原理 ：用化学交联法将酶与抗体分子连接 ，染色时在用特异性抗体与标本中抗原结 合之后 ，将桥抗体结合于其上 ，再将抗酶抗体结合于桥抗体上 ，最后把酶结合在抗 酶抗体上 ，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来 。 PAP法的基本原理与酶桥法相同 ，只是酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶 ，把两个步骤合并为一个步骤 ，其效果更好。

4.亲和组织（细胞）化学法 ，已经建立的方法有哪些？

亲和组织（细胞）化学 ：是利用两种物质间具 有的高度亲和能力及其可标记性 ，以显示其中一种物质的方法 。这些亲和物质如葡萄球菌A蛋白（SPA）与 免疫球蛋白（IgG） 、生物素与卵白素 、植物凝集素与糖分子 、受体与配体 、酶 、同位素等都可作为标记物而与之结合 。

亲和免疫组织（细胞）化学=亲和组织（细胞）化学+免疫组织（细胞）化学亲合组织化学技术引入免疫细胞化学后使其敏感性进一步提高 ，更利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的检测 。 目前已经建立的方法有LAB法 、BRAB法 、ABC法 、SP法等 。

1. 免疫组化制片常用固定剂及固定注意事项 。常用的固定剂多聚甲醛 、戊二醛 、Bouin固定液

注意事项 ：免疫组化固定方法的原则是在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下 ，应选用浓度最低的固定液和最短的固定时间 。

为此 ，固定组织时应该 ： 1）组织新鲜 ，尽早 、尽快固定 。 2）组织块尽量小 。

3）固定后充分水洗 ，减少固定液造成的人工假象 。 4）针对抗原 、染色法选择最佳的固定方法 。

2.SP法免疫组化染色步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水（或恒冷箱切片） 。 2. 0.01mol/L PBS洗 ，2×5min

3. 0.3%H2O2--甲醇 ，室温孵育10min（以消除内源性过氧化物酶的活性） ； 4. 蒸馏水冲洗 ，PBS洗3×5min ；

5.（0.1%TritonX-100PBS ，15min（增加细胞膜透性）） 6. 抗原修复 。PBS洗3×5min ；

7. 滴加10%正常山羊血清（PBS稀释） ，室温10-15min ，倾去血清 ，勿洗 。（封闭非特异性抗体的结合位点）

8.滴加一抗 ，置湿盒内 ，37 ℃,1h 或４℃冰箱过夜（4℃过夜后在37℃复温） ； 9. PBS洗3×5min ；

10.滴加生物素标记的二抗 ，37℃孵育30min ～1h ；

11. PBS洗3×2min ；

12.三抗（SP复合物） ，37℃孵育30 min ～1h ；

13. PBS洗3×5min ；

13. DAB显色剂显色3-10min （镜下显色） ，蒸馏水终止显色 ，（或用其他显色剂 ，显色后直接用水溶性封片剂封片） 14.（苏木精复染）

15.常规梯度酒精脱水 ，二甲苯透明 ，中性树胶封片 。

结果 ：DAB显色的抗原-抗体复合物呈棕色 ，细胞核蓝色。若用AEC显色剂显色 ，需用水溶性封片剂封片 ，抗原-抗体复合物呈红色 。

3. 免疫组化ABC法操作步骤 。

1 、冰冻切片或石蜡切片脱蜡至水 ；0.01mol/L pH7.4 PBS洗5min×3次 ；

2 、0.3%H2O2—甲醇溶液 ，室温 ，10~30min 。蒸馏水洗 。PBS洗5min×3次 ； 3 、（抗原修复） 4 、（冰冻切片分别用0.01%亲和素和0.01%生物素溶液作用切片20min，抑制内源性生物素 ；PBS洗3min×3次; ） 5 、10%正常山羊血清 ，室温10-15min ，倾去血清 ，勿洗;

6 、滴加稀释的一抗 ，湿盒内37 ℃30-60 min ，或4℃冰箱内48~72h ；PBS洗3min×3次; 7 、滴加生物素标记二抗 ，37 ℃30-60min; PBS洗5min×3次; 8 、滴加三抗（ABC（SABC)复合物） ，37 ℃30-60min; PBS洗5min×3次 9 、DAB-H2O2液显色 ，用蒸馏水洗终止反应 ； 10 、（复染）脱水 ，透明 ，封片 。

结果 ：DAB显色的抗原-抗体复合物呈棕色 ，（细胞核蓝色） 。若用AEC显色剂显色 ，需用水溶性封片剂封片 ，抗原-抗体复合物呈红色 。

4.抗原修复的目的及常用方法 。目的 ：充分暴露被交联封闭的抗原决定簇 。 常用的方法有 ：1 、热修复法 ：单纯加热法 ，高压加热法 ，微波加热法 2 、化学修复法 ：胰蛋白酶消化处理 ，胃蛋白酶消化处理

5.免疫组织化学实验中对照组的设立 。为确定结果的可靠性 ，在实验中必须设臵对照 。通常是针对第一抗体设立对照 ，包括 ：阳性对照 、阴性对照 、替代对照 、空白对照 、自身对照和吸收试验等 。 （1）阳性对照

用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色 ，阳性对照应呈阳性结果 ，即为阳性对照 。 （2）阴性对照

用已知不含抗原的标本作对照 ，实验结果为阴性 ，即为阴性对照 。阴性对照中还包括空白对照 、替代对照 、吸收和抑制对照等 ，用以排除假阳性结果。

6.免疫组化染色过强 、非特异性背景染色 、染 色弱的可能原因及解决方法 。 1 、染色过强

原因1 ：抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长

解决办法 ：降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1h或4℃过夜 原因2 ：孵育温度过高 ，孵育温度超过37℃ 。一般室温20-28℃

原因3 ：DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟 ，以显微镜下观察为准 。 2 、非特异性背景染色

原因 解决办法

操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5min ，振荡

组织中含过氧化物酶未阻断 可再配臵新鲜0.3%H2O2-甲醇封闭 ，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3 、染色弱

原因 解决办法

抗体浓度过低或孵育时间过短 提高抗体浓度 ，孵育时间不能少于60min 试剂超过有效使用期 及时更换试剂

操作中 ，滴加试剂时缓冲液 每步滴加试剂前沥干切

未沥干 ，致使试剂稀释 片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）

室温太低 ，低于15℃ 若室温低于15 ℃ ，要改放在37℃孵育箱孵育30-60min（或4℃冰箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10min 4 、染色阴性

原因 解决办法

操作步骤错误 重新试验 ，设立阳性对照

组织中无抗原 设立阳性对照片 ，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 1 、原位杂交概念 、原理

原位杂交定义 ：将分子杂交技术与组织化学技术相结合 ，在组织和细胞原位进行核酸杂交并对其进行检测的技术 。 原位杂交的基本原理涉及 ：核酸标记探针 ，核酸分子杂交 ，杂交体的原位检测

基本原理 ：首先标记已知序列的核酸片段（DNA或RNA）作为检测物 ，即核酸探针 ，再利用含有探针的反应液（杂交液）作用于待检组织，在适宜条件下 ，探针与标本中待测靶核酸按照碱基配对的原则在原位特异性结合形成杂交体 ，通过组织化学或免疫组织化学显示或检测标记物 ，在原位检测细胞内靶核酸片段 。 2 、核酸探针概念 、常用的核酸探针

核酸探针 ：指已被标记的已知序列的核苷酸片段 。能与其互补的核苷酸片段杂交形成双链而用于样品中特定基因序列的检测 。

常用核酸探针 ：DNA探针 、cDNA探针 、RNA探针与cRNA探针 、寡核苷酸探针 3 、原位杂交基本步骤原位杂交的基本步骤和原则 (1)标本制备（取材 、固定 、切片）

(2)杂交前处理（增强标本的通透性和核酸探针的穿透性 、预杂交） (3)杂交反应 (4)杂交后处理 (5)显示或检测

4 、预杂交 、杂交反应

预杂交 ：杂交前用不含核酸探针的杂交液在杂交温度下预先孵育切片 ，以封闭或阻断标本中可能与核酸探针产生非特异性结合的杂交点 ，达到减低背景染色的目的 。此步骤是降低背景着色的一种有效手段 。

杂交反应 ：用杂交液孵育标本切片 ，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下，与标本内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程 。

5 、细胞凋亡 、凋亡小体及细胞凋亡的形态学特征 。

细胞凋亡 ：多细胞有机体为调控机体发育 、维持内环境稳定 ，由基因控制的细胞主动性死亡过程 。 细胞凋亡的形态学特征

●细胞体积变小 ，细胞质浓缩 。

●细胞膜失去原有特定形状 ，但胞膜结构完整 ，有泡状突起 。 ●细胞核染色质浓缩 ，聚集在核膜周围 。

●细胞膜内陷形成凋亡小体(Apoptotic bodies) 。 ●无内容物外溢 ，因而不引起周围的炎症反应 。

凋亡小体 ：细胞凋亡过程中 ，胞核和胞质经常出芽和碎裂成一些有膜包被 、内涵物不外溢的小块 ，即凋亡小体 。